Biosensors for label-free continuous monitoring of microfluidic cell cultures

Mikrofluidik ist eine aufstrebende Technologie, die sich besonders für die Entwicklung neuartiger Systeme für zellbasierte Testung eignet.[1] Während heutzutage bereits zahlreiche ausgeklügelte und spezialisierte mikrofluidische Plattformen existieren, ist die Zellanalyse zumeist noch auf mikroskopische Beobachtung beschränkt.[2] Mikroskopische Aufnahmen können zwar wichtige qualitative Informationen liefern, eine Quantifizierung der Messung ist jedoch meist nicht möglich. Um mikrofluidische Zellkulturexperimente optimal auswerten zu können braucht es quantitative Analysenmethoden, die idealerweise kontinuierliche Messungen ermöglichen und ohne zusätzliche Arbeitsschritte automatisierbar sind. All diese Anforderungen werden von markerfreien Biosensoren erfüllt, da diese für invasive Langzeitmessungen von lebenden Zellpopulationen geeignet sind. Das Ziel dieser Arbeit war daher die Entwicklung markerfreier Zellsensoren für die Integration in mikrofluidische Systeme. Drei verschiedene Plattformen wurden designet, hergestellt, optimiert, charakterisiert und zur Überwachung von Zellkulturen verwendet. Als erstes wird ein optischer Sensor zur 2D Sauerstoffbestimmung präsentiert. Die Sauerstoffmessung wird dabei mittels einer fluoreszierenden Schicht bestehend aus einem sauerstoffsensitiven und einem nicht sauerstoffsensitiven (Referenz-) Fluoreszenzfarbstoff bewerkstelligt. Der Sensor erlaubt es Sauerstoffgradienten mit hoher zeitlicher und örtlicher Auflösung zu verfolgen, was insbesondere für 3D Kulturen mit potentieller Sauerstofflimitierung relevant ist. Als nächstes wird ein System mit kombinierter optischer und elektrischer Zellmessung präsentiert. Während Lichtstreuungsmessung Auskunft über Zellzahle und -morphologie gibt, erlauben Impedanzsensoren die Messung der Zell-Substratinteraktion. Zusammengenommen, kann durch die komplementären Sensoren die Verlässlichkeit von Zellexperimenten verbessert und Klarheit bei uneindeutigen Resultaten geschaffen werden. Schließlich wurde das duale Messsystem noch erfolgreich verwendet um dynamische Zell-Zellinteraktionen in einem mikrofluidischen Ko-Kulturexperiment zu beobachten. Das dritte in dieser Arbeit entwickelte System ist eine integrierte Messstation für hochfrequente (bis 20 MHz) Impedanzmessungen. Das System wird verwendet um verschiedene Zellantworten wie Zelltod, Serumentzug, β-Adrenorezeptoraktivierung und Entzündungsreaktionen zu identifizieren. Abschließend werden die generellen Vorteile aber auch Nachteile der neu entwickelten markerfreien Biosensoren für mikrofluidische Systeme präsentiert Microfluidics is an emerging technology that provides the means to develop physiologically relevant cell-based assays.[1] While numerous sophisticated and specialized microfluidic systems for cell cultivation have been developed, even today assay read out is often limited to microscopic cell observation.[2] While microscopic images provide valuable qualitative information, quantification is usually difficult. By contrast, meaningful analysis of microfluidic cell cultures should enable quantitative, continuous readings with good temporal resolution and be amenable for automation without requiring multiple handling steps. Here label-free approaches are ideally suited, because they allow for long term non-invasive monitoring of cell population dynamics. Therefore the goal of this thesis was the development of label-free biosensors that can be integrated into microfluidic devices. Three different integrated sensor systems have been fabricated, optimized, characterized and applied for cell culture monitoring. First, an optical sensor for oxygen imaging is presented. A fluorescent sensor layer containing an oxygen sensitive fluorescent dye and a reference dye enables ratiometric oxygen measurements. Spatial and temporal oxygen gradients could be followed with high accuracy which provides crucial information especially for 3D cell cultures, where oxygen supply can become a limiting factor. Next, optical light scattering detection was combined with electric cell impedance measurements in a single device. While light scattering measurements provides important Information on cell numbers and morphology, impedance sensors are sensitive towards cell-substrate interaction. Together the complementary sensors enabled improved assay reliability and helped to clarify otherwise ambiguous assay results. Finally, the dual-parameter cell-chip was applied to monitor dynamic cell-cell interactions in microfluidic co-cultures. The third presented system is a lab-on-a-chip station for high frequency impedance monitoring that enables measurements up to 20 MHz. Application of the system to successfully identify various cell responses including cell death, serum starvation, β-adrenergic receptor activation and inflammatory responses are presented. Finally, the general advances and also limitations of the newly developed microfluidic systems with integrated label-free biosensors are presented.