Studying Interfacial Processes Using Nanosecond Pump-Probe Brewster Angle Reflectometry and Fluorescence Spectroscopy

Brewster Winkel Mikroskopie wurde entwickelt, um Bilder von Monolagen oder dünnen Filmen aufzunehmen. Es ist eine ideale Methode um Konformationsänderungen an Grenzflächen zu verfolgen. In dieser Arbeit wird die Technik der Brewster Winkel Reflektometrie vereinfacht, indem man das normalerweise verwendete Goniometer durch eine zylindrische Linse ersetzt. Dieser neuartige Zugang erlaubt Messungen mit einzelnen Laserpulsen, die trotzdem die Winkelabhängigkeit um den Brewster Winkel erfassen. Mithilfe von zwei synchronisierten Lasern in Pump-Probe Konfiguration ist es möglich die Kinetik von Konformationsänderungen zu messen, indem man die Verzögerungszeit zwischen Pump und Probe variiert. Verwendet man den verstellbaren Lichtblitz eines optischen parametrischen Oszillators statt des Probe- Lasers, kann man mehrere Kinetiken verschiedener Wellenlängen zu Spektren von transienten Zuständen zusammenfassen. Monolagen oder dünne Filme von amphiphilem Spiropyran, Spirooxazine und Benzophenone sind geignete Modellsysteme, um mittels qualitativer Messungen die Fähigkeiten des neuen Systems zu demonstrieren. Die Zeitauflösung im Nanosekundenbereich ist nur durch den zeitlichen Überlapp der beiden Laser-, bzw Oszillatorpulse begrenzt. Proteo-Lipobeads sind eine neue Plattform für Funktionalitätsstudien an Membranproteinen. Sie bestehen aus einem Zentralpartikel an dem die Membranproteine mittels his-tag Technologie angebunden werden. Während einer in situ Dialyse bildet sich eine biomimetische Membran zwischen den Proteinen. Cytochrome c Oxidase von Paracoccus denitrificans wurde als erstes Protein gewählt um diese Methode zu demonstrieren. Die Funktionalität des Proteins wurde mittels zeitaufgelöster Fluoreszenzspektroskopie und Oberflächenplasmonenverstärkter-Fluoreszenzspektroskopie gezeigt. Hierzu wurden Intensitätsänderungen von spannungssensitiven Fluoreszenzmarkern in der Lipidmembran aufgezeichnet, während das Protein unter Beigabe von Ascorbinsäure und Cytochrome c arbeitet. Brewster angle microscopy has been developed as a tool to image monolayers and thin films. It is an ideal method to follow conformational changes at interfaces. In this work the technique of Brewster angle reflectometry is simplified by replacing the goniometer usually employed for these measurements with a cylindrical lens. This novel approach allows single shot measurements of Brewster´s Angle and its vicinity. Using two synchronized nanosecond pulsed lasers in pump-probe configuration it is possible to measure the kinetics of photoinduced conformational changes by altering the delay between pump and probe pulses. By using the tunable output of an optical parametric oscillator it is even possible to combine transient kinetics from different wavelengths, thus effectively measuring transient spectra. Model compounds used in this work are amphiphilic spiropyran, spirooxazine and benzophenone. Qualitative measurements on organic photochromic dyes show that the setup is feasible for conversion kinetics measurements in monolayers on water or spin-coated thin films on solid substrates. The nanosecond time resolution is only limited by the temporal convolution of the optical parametric oscillator or laser probe pulse and the pump laser pulse. Proteo-lipobeads are presented as a new cell free platform for functional studies on membrane proteins and as a promising new type of bioassays. They consist of a central particle, to which solubilized his-tagged Membrane proteins are attached with the help of ion-functionalized linkers. During in situ dialysis a biomimetic membrane self-assembles between the Protein scaffold. Cytochrome c oxidase from Paracoccus denitrificans is used as a first protein to show the viability of the approach. Functionality of the Protein is demonstrated by employing time-resolved fluorescence spectroscopy as well as surface plasmon enhanced fluorescence spectroscopy. This is done by monitoring the intensity changes of voltage-sensitive fluorescent dyes bound to the lipid phase after initiating the enzyme cycle with cytochrome c in the presence of ascorbic acid and oxygen.